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手性色譜柱(Chiral HPLC Columns)是由具有光學活性的單體,固定在矽膠或其它聚合物上制成手性固定相(Chiral Stationary Phases)。通過引入手性環境使對映異構體間呈現物理特征的差異,從而達到光學異構體拆分的目的。要實現手性識別,手性化合物分子與手性固定相之間至少存在三種相互作用吉泽并良 qvod_国产丝袜女孩公_破廉耻学园快播手性識別能力,但可能引起色譜峰變寬而導致分離變差。因此確定手性分析方法過程中要考慮柱溫的影響,確定最優柱溫。

        迄今為止,尚沒有壹種類似十八烷基鍵合矽膠(ODS)柱的普遍適用的手性柱。不同化學性質的異構體不得不采用不同類型的手性柱,而市售的手性色譜柱通常由國外企業壟斷,價格昂貴,目前我們廣州研創公司自主研發的手性柱是國內唯壹壹家。

         如何根據化合物的分子結構選擇適用的手性色譜柱是非常重要的。


根據手性固定相和溶劑的相互作用機制,Irving Wainer首次提出了手性色譜柱的分類體系:

  • (2)

  • 第1類:通過氫鍵、π-π作用、偶級-偶級作用形成復合物。
    第2類:既有類型1中的相互作用,又存在包埋復合物。此類手性色譜柱中典型的是由纖維素及其衍生物制成的手性色譜柱。
    第3類:基於溶劑進入手性空穴形成包埋復合物。這類手性色譜柱中最典型的是由Armstrong教授開發的環糊精型手性柱[2],另外冠醚型手性柱和螺旋型聚合物,如聚(苯基甲基甲基吉泽并良 qvod_国产丝袜女孩公_破廉耻学园快播柱分為以下幾種:
    刷(Brush)型或稱為Prikle型
    纖維素(Cellulose)型
    環糊精(Cyclodextrin)型
    大環抗生素(Macrocyclic antibiotics)型
    蛋白質(Protein)型
    配位交換(|Ligand exchange)型
    冠醚(Crown ethers)型

     

    1、 刷型:


    刷型手性色譜柱的出現和發展源於Bill Prikle及其同事的卓越工作。六十年代,Bill Prikle將手性核磁共振中的成果運用到手性HPLC固定相研究中,通過不斷實踐,發明了應用範圍較廣、柱效很好的手性色譜柱。刷型手性色譜柱是根據三點識別模式設計的,屬於Irving Wainer分類中的第壹種類型。
    刷型手性固定相分為π電子接受型和π電子提供型兩類。最常見的π電子接受型固定相是由(R)-N-3,5-二硝基苯甲酰苯基甘氨酸鍵合到γ-氨丙基矽膠上的制成。此類刷型手性色譜柱可以分離許多可提供π電子的芳香族化合物,或用氯化萘酚等對化合物進行衍生化後進行手性分離。
    π電子供給型固定相常見的是共價結合到矽膠上的萘基氨基酸衍生物,這種固定相要求被分析物具有π電子接受基團,例如二硝基苯甲酰基。醇類、羧酸類、胺類等,可以用氯化二硝基苯甲酰、異腈酸鹽、或二硝基苯胺等進行衍生化後,用π電子供給型固定相達到手性分離。吉泽并良 qvod_国产丝袜女孩公_破廉耻学园快播
    近來,刷型固定相出現了π電子供給和接受基因的混合固定相。如:WHELK-O和BLAMO,及α-BURKE-Ⅱ固定相。α-BURKE-Ⅱ相十分適用於β-阻斷劑的手性分離。典型的流動相為二氯甲烷-乙醇-甲醇混合物,比例為85:10:5。加入10mM醋酸銨可以調整保留時間。SS BLAMO Ⅱ,同時具有π電子供體區和受體區,形成手性裂縫,因此對於某些分子具有很高選擇性。

     

  • (3)
  • 2、纖維素型:


    纖維素型手性色譜柱的分離作用包括相互吸引的作用及形成包埋復合物。它們屬於Wainer分類中的第2種類型。市售的手性色譜柱為微晶三醋酸基、三安息香酸基、三苯基氨基酸鹽纖維素固定相。很多化合物可通過此類型的色譜柱得到分離。這種類型的手性色譜柱種類也很齊全。流動相使用低極性溶劑,典型的流動相為乙醇-己烷混合物。但特別要註意由於氯可以使纖維素從矽膠上脫落,因此要確保流動相中無含氯溶劑。
    這種類型的手性色譜柱主要的制造商是日本的Daicel公司和我們廣州吉泽并良 qvod_国产丝袜女孩公_破廉耻学园快播能面臨到的所有手性化合物。此類柱子通常用於正相系統,用正己烷-乙醇,
    正己烷-異丙醇混合溶劑為流動相。OD柱也可用於反相的情況,但流動相必須含有高濃度的高氯酸鹽緩沖液,以防止固定相溶解。即使這樣,使用較長時間以後色譜柱也難免要受到損害,但是在某些情況下使用反相系統分離效果要優於使用正相系統。

     

    3、環糊精型:


    環糊精是通過Bacillus Macerans 澱粉酶或環糊精糖基轉移酶水解澱粉得到的環型低聚糖。通過控制環糊精轉移酶的水解反應條件可得到不同尺寸的環糊精。市售的環糊精主要是α、β、γ三種類型,分別含6、7、8個吡喃葡萄糖單元。環糊精分子成錐筒型,構成壹個洞穴,洞穴的孔徑由構成環糊精的吡喃葡萄糖的數目決定。環糊精類型及洞穴的孔徑等見下表:

    環糊精        糖元數目        洞穴孔徑        可進入洞穴的分子類型,手性中心數目
    α        6        4.5-6.0        5-6元環的芳香族化合物 ,30
    β        7        6.0-8.0        聯苯或萘 , 35
    γ        8        8.0-10.0        取代芘和類固醇, 40

    2,3位仲羥基分布在環糊精洞口,6位伯羥基在環糊精分子的外部,這意味著洞穴內部是相對疏水的區域。用環糊精手性固定相產生手性識別要求被拆分物的疏水部分能嵌入環糊精洞穴中,形成可逆的、穩定性不同的包合物,環糊精洞口的羥基和被拆分物的極性基團相互作用。

    由於形成包合物速度較慢,因此可能導致色譜峰峰形較差,同樣也影響了其在制備色譜中的應用。環糊精固定相的選擇性取決分析物的分子大小;α-環糊精只能允許單苯基或萘基進入,β-環糊精允許萘基及多取代的苯基進入,γ-環糊精僅用於大分子貼類。β-環糊精手性固定相應用範圍最廣。Ibuprofen通過β-吉泽并良 qvod_国产丝袜女孩公_破廉耻学园快播H值。高的流速會降低形成復合物的能力,低流速分離效果較好,0.5-1ml/min的流速最好。另外,增加緩沖液的濃度可以克服流速的影響,因為它可以增加環糊精洞穴和流動相的吸引力。

    常用緩沖液及其使用濃度如下表所示:


    緩沖液                                                 濃度                                                      目的
    TEAA(乙酸三乙胺鹽)                0.01-2%                                 
    NH4NO3                                      10-500mM                                 (用於減小包埋)
    檸檬酸鹽                                      10-200mM                                  (特別適合於酸性化合物)
    醋酸銨                                           10-200mM       

     

    pH值選擇見下表:

     

    緩沖液        pH值        目的
    醇和胺        pH4        (加強NH的離子化)
    酸                 pH7

    優化手性分離條件要考慮的方面有:pH值對分離度的影響;流速對分離度的影響;柱溫、有機相比例、緩沖鹽濃度對分離度的影響。
    環糊精的修飾:最近,我們研創對環糊精的修飾使環糊精型手吉泽并良 qvod_国产丝袜女孩公_破廉耻学园快播。衍生化反應包括乙基化、S-羥基丙基化、生成S或R-萘基乙基氨基甲酸鹽、3,5二甲基苯基氨基甲酸鹽和環狀對甲苯酰酯。這些新型的環糊精固定相有許多優點,它們可以分離更多化合物,價格上也有競爭力,由於改進了手性識別能力使其更適用於制備色譜。

  • (4)
  •  

    4、配位交換型:


    手性配位交換色譜(Chiral Ligand Exchange Chromatography,CLEC)由Davankov發明,是通過形成光學活性的金屬絡合物而達到手性分離,屬於Irving Wainer分類中的第4類手性固定相,主要用於分離氨基酸類。

    由於此類固定相是由手性氨基酸—銅離子絡合物鍵合到矽膠或聚合物上形
    成,因此流動相中必須含有銅離子以保證手性固定相上的銅離吉泽并良 qvod_国产丝袜女孩公_破廉耻学园快播β- 氨基酸很難用手性
    配位交換色譜得以分離。手性配位交換色譜可用於制備,由於流動相中存在銅離子,雖然銅離子能用離子交換柱除去,但增加了樣品處理的困難。